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　　微流控技術是一種通過微小的通道和微型裝置對流體進行精確操控和分析的技術。它是現代醫學技術發展過程中的一種重要的生物醫學工程技術，具有廣泛的應用前景和重要性。它在高通量分析、個性化醫療、細胞篩選等方面有著巨大的潛力，Aigtek安泰電子今天就將為大家分享一篇微流控領域研究成果，一起接著往下看吧~

　　惡性腫瘤是全球人類第二大死亡原因。近期，在發達國家中，由它引起的死亡甚至經已超過心血管疾病，使之成為發達國家的第一大死亡原因。實體瘤會在其周邊形成一個抑制環境，如營養耗竭，廢物積累，缺氧，pH值酸化等。這種環境會對人體的免疫系統造成極大的負擔，從而嚴重損害效應免疫細胞，如T細胞和自然殺傷細胞(NK)破壞腫瘤細胞的能力。

　　在過去的幾年里，免疫學方面的多項突破，如嵌合抗原受體(CAR)T/自然殺傷細胞(NK)和免疫檢查點抑制劑(ICIs)，在血液惡性腫瘤(如急性髓細胞白血病和急性淋巴細胞白血病)的治療中取得了巨大的成功(2)。因此，科學家和臨床醫生正在努力將免疫療法推廣到實體瘤的治療上。然而，驅動免疫抑制的具體分子機制，以及免疫細胞適應抑制環境的能力，尚不完全清楚，并且傳統的二維(2D)模型并不能很好的模擬三維實體瘤所形成的復雜的腫瘤微環境(TME)。

近期， University of Wisconsin的Jose M. Ayuso 與David J. Beebe聯合 Morgridge Institute for Research的Melissa C. Skala在Science Advances （IF=14.136)上發表題為Microfluidic tumor-on-a-chip model to evaluate the role of tumor environmental stress on NK cell exhaustion的文章。他們使用體外微流控芯片腫瘤平臺（圖1），實現了對乳腺癌實體瘤微環境中四個要素：營養、pH值、增殖和壞死的梯度模擬。通過對腫瘤細胞和免疫細胞的觀測，評估了NK細胞如何對腫瘤誘導的抑制環境做出反應。

　　首先，他們構建了一個腫瘤微流控模型。該模型有一個中央微室，微室一側有一根PDMS小棒，其余部分則填入混合了乳腺癌細胞(即MCF7)的膠原水凝膠。小棒在水凝膠固化后被移除，形成管狀空腔。再在空腔內壁鋪上一層內皮細胞（人臍帶內皮細胞HUVECs），并注入培養基，就形成了一個可向周邊輸送營養的類血管結構（圖1B）。通過比較可以觀察到，距離類血管結構越遠的乳腺癌細胞的活性和增值速率會逐步降低。

　　圖1腫瘤芯片

　　接下來，團隊在膠原水凝膠中同時均勻混入乳腺癌細胞（MCF7)和自然殺傷細胞（NK-92）來評估NK-92細胞在響應腫瘤芯片產生的環境時的分子變化。經逆轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)實驗和非分級聚類圖分析顯示，NK-92與免疫衰竭相關的多個基因，以及與營養饑餓、缺氧和血管生成相關的基因在培養一周后，表達量都出現顯著上調。這說NK-92在該環境下逐漸衰竭，并激活了一些適應性反應。而與NK細胞存活、增殖和激活相關的多個基因則顯著下調，突出了腫瘤芯片微設備內部產生的環境的免疫抑制作用(圖2C)。通過從芯片不同部位取NKcell進行比較，團隊發現不同區域的NK-92細胞的基因表達也大不相同。同近端區域相比，遠端區域的NK細胞增殖能力較弱，對趨化因子的反應較弱，但它們的促炎反應基因的表達程度卻出現上調。

　　那么NK細胞衰竭的現象到底是由微裝置中產生的環境應激引起的，還是僅僅是由于腫瘤細胞長達7天的慢性激活引起的呢？

　　圖2腫瘤芯片混入NK細胞培養引發NK細胞衰竭

　　為了回答這個問題，該團隊在養分充足的孔板里，重新培養混入了MCF-7的NK-92細胞并培養相同的時間。經過同樣的基因表達檢測流程，他們發現此時NK-92的基因表達與培養在腫瘤芯片中的大相徑庭。于是可以得出結論，NK細胞衰竭的主要因素是環境壓力，而不是腫瘤細胞對NK的慢性激活。而這種區別，同時也體現了芯片腫瘤模型相對于傳統檢測模型的優勢，驗證了模擬實體瘤微環境與否對實驗結果的準確性存在巨大的影響

　　圖3比較在微環境呈梯度變化的腫瘤芯片與營養供給充足的傳統三維培養環境中，NK細胞的耗竭狀況。

　　基因表達分析表明，腫瘤芯片模型較傳統孔板而言能觀察到更明顯的免疫耗竭，其中耗竭標記物PD-1和IDO-1的表達出現了大幅的上調。因此，團隊開始從應用角度評估該芯片，使用它來測試針對免疫衰竭的免疫療法的潛力。他們在芯片中加入抑制耗竭標記物表達的藥物，再對腫瘤細胞的成活率進行檢測，以表征NK細胞的免疫活性（圖4）。最終，實驗結果證明免疫調節因子如檢查點（ICIs）和代謝（IDO-1）抑制劑在一定程度上減輕了免疫衰竭。然而，完全根除位于腫瘤最內層的腫瘤細胞可能需要針對腫瘤微環境效應的新方法。

　　圖4ICIs和IDO-1抑制劑在傳統檢測和腫瘤芯片上的作用

　　逆轉或防止免疫衰竭的新療法有很大的潛力，但人們對驅動這一過程的機制仍知之甚少。因此，該團隊進一步開始研究將這些出現耗竭現象的免疫細胞從受抑制的環境中移出，看它們是否還能恢復到原來的表型。于是在芯片中培養一周后，混有MCF-7和NK-92的膠原水晶膠被取出芯片腔室。NK-92細胞被分離出來后再轉移至環境壓力小的培養瓶里再養一周。觀察發現，幾個在腫瘤芯片培養細胞中逐漸上調的與免疫衰竭和應激反應相關的基因(如IDO-1、CCl28、VEGF和MICA)，在傳統燒瓶中培養1周后恢復到原來的值(圖5C)。這說明NK細胞在與腫瘤細胞共培養后可能還保留了一些原始細胞狀態的記憶。

　　圖5在腫瘤芯片平臺上培養過后，NK細胞的恢復

　　分析RT-qPCR的數據表明暴露的NK細胞與未暴露的NK細胞具有不同的分子表型。因此，該團隊還評估了暴露NK細胞中這些分子改變所帶來的功能層面的后果（圖6）。最終，實驗結果強調了芯片上腫瘤產生的環境壓力會顯著影響NK細胞的分子表型和功能。

　　圖6暴露前后NK細胞的功能變化

　　隨著科技的不斷進步，腫瘤芯片技術可能會加速各種新型的免疫療法的發展，為相關實驗提供一個多功能的工具，成為連接體外平臺和動物模型之間的橋梁。

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